La citometría de flujo y otras técnicas de células individuales no consiguen un aislamiento real de células mononucleares de leucocito, sólo una diferenciación celular

  La citometría de flujo y otras técnicas de células individuales no consiguen un aislamiento real de células mononucleares de leucocito, sólo una diferenciación celular.

Aislamiento de leucocitos del cerebro, la médula espinal y las meninges para el análisis de citometría de flujo

 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6060638/

 Desarrollada por primera vez en la década de 1960, la citometría de flujo es una tecnología que permite el análisis de poblaciones de células mediante la creación de una corriente de fluido de una sola célula que pasa a través de una celda de flujo (Fulwyler, 1965). Se utilizan láseres sintonizados a longitudes de onda específicas para excitar el flujo de una sola célula, y luego la luz emitida se recolecta y amplifica para su análisis (Chattopadhyay, Hogerkorp y Roederer, 2008; Herzenberg et al., 2002; Hulett, Bonner, Sweet y Herzenberg , 1973). Desde sus inicios, la citometría de flujo ha evolucionado significativamente. El desarrollo de nuevos láseres, etiquetas celulares y tecnología de procesamiento ha permitido a los investigadores utilizar la citometría de flujo policromática para evaluar poblaciones inmunes heterogéneas (Chattopadhyay et al., 2008; Chattopadhyay et al., 2006; Perfetto, Chattopadhyay y Roederer, 2004) y determinar sus tasas de proliferación (Lyons, 2000; Lyons & Parish, 1994), estado de activación, eventos de señalización (Krutzik, Clutter, & Nolan, 2005; Krutzik & Nolan, 2003), etc. de forma automatizada (Aghaeepour et al., 2013). ). Además, los avances recientes en técnicas genómicas de células individuales, como la secuenciación de ARN, han proporcionado transcriptomas celulares de células individuales, lo que nos permite identificar y perfilar poblaciones de células inmunitarias heterogéneas de varios tejidos (Buettner et al., 2015; Keren-Shaul et al. , 2017; Prinz et al., 2017; Xue et al., 2014).

 La citometría de flujo y otras técnicas de células individuales dependen de la generación de suspensiones de células viables. Por ejemplo, la clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS) permite el aislamiento de células viables basándose en etiquetas fluorescentes (Julius, Masuda y Herzenberg, 1972). Técnicas como FACS requieren una extracción eficiente de células de tejidos de interés y tinción con fluoróforos espectralmente distintos. La viabilidad y pureza de las células aisladas a menudo determina la calidad de los datos resultantes. Esta unidad describe las técnicas necesarias para extraer el cerebro, el parénquima de la médula espinal y las meninges del cráneo y los cuerpos vertebrales (consulte el Protocolo de apoyo 1), así como los métodos para extraer leucocitos del cerebro, la médula espinal (consulte el Protocolo básico 1) y meninges (ver Protocolo Básico 2). También se proporciona una guía para el análisis y el inmunofenotipado de las poblaciones (Figura 2 y ​y 3)3).

Puedes leer el proceso completo en este enlace  https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6060638/

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No se realizado un AISLAMIENTO REAL de la célula mononuclear linfocito, se trata de un aismiento grupal por medio de la tinción celular agregando 50 μL de PBS 2% FCS

 El 52,9 % de las células de entrada de linfocitos eran células T CD3+ (panel central); dentro de los cuales el 53,4 % eran CD4+ y el 38,2 % CD8+ (panel derecho), y el 1,3 % de estos linfocitos eran células B CD19+ (panel central).

 Aislamiento de leucocitos vivos de músculos inflamatorios humanos

  https://www.mdpi.com/2409-9279/4/4/75/htm

 4.2. Caracterización fenotípica de las células aisladas por citometría de flujo

 La composición de las subpoblaciones de células inmunitarias dentro de los leucocitos recuperados puede determinarse mediante citometría de flujo. Este procedimiento no forma parte de este protocolo, sino que puede utilizarse como control de calidad y/o como paso de análisis inicial de los leucocitos aislados de músculo.
Para medir con precisión la proporción de las subpoblaciones obtenidas, se pueden utilizar 25.000 de las células recuperadas. Cuando se extraen recuentos bajos de células, tan solo 5000 células son suficientes para realizar este análisis, aunque las proporciones medidas serán menos precisas.
Nota: Al realizar la tinción de células con un número bajo de células, es preferible utilizar una placa de 96 pocillos con fondo en U en lugar de tubos FAC de 5 ml, ya que esto minimizará la pérdida de células durante el paso de lavado.
●Transfiera 25.000 células (o menos) a un pocillo de una placa de 96 pocillos con fondo en U.
●Teñir las células agregando 50 μL de PBS 2% FCS que contiene los siguientes anticuerpos: CD3ε BV510 (UCHT1, Becton Dickinson, Macquarie Park, NSW, Australia), CD4 FITC (OKT4, BioLegend, Wangara, WA, Australia), CD8 APC- H7 (SK1, Becton Dickinson), CD19 APC-FIRE750 (HIB19, Becton Dickinson) y dejar durante 30 min entre 4-20 °C protegido de la luz directa.
●Al final del período de incubación, complete hasta 250 μL usando PBS 2 % FCS para lavar los anticuerpos no unidos. Coloque la placa en una centrífuga y centrifugue durante 5 min a 300 × g.
●Deseche el sobrenadante sin perturbar el sedimento celular, que podría no ser visible.
●Vuelva a suspender el sedimento celular en 300 μL de PBS FCS al 2 % y transfiéralo a un tubo FAC para su análisis en un citómetro de flujo Beckman Coulter (Lane Cove West, NSW, Australia) Gallios® usando el software de adquisición Kaluza®.
●Nuestros datos sin procesar de citometría de flujo se analizaron utilizando el software de análisis FlowJo v10.7.1 (Beckson Dickinson, Ashland, OR, EE. UU.). La "puerta de linfocitos" se definió en función de las características FS-A/SS-A (Figura 3, panel izquierdo). En esta biopsia, encontramos que el 52,9 % de las células de entrada de linfocitos eran células T CD3+ (panel central); dentro de los cuales el 53,4 % eran CD4+ y el 38,2 % CD8+ (panel derecho), y el 1,3 % de estos linfocitos eran células B CD19+ (panel central).

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 una separación de alto rendimiento (~1,3 × 105 células/min) de linfocitos con alta viabilidad (>95 %) NO es un AISLAMIENTO REAL de una célula mononuclear, en este cado de un linfocito

 Aislamiento rápido y seguro de linfocitos B y T de sangre periférica humana a través de canales de microfluidos en espiral

 https://www.nature.com/articles/s41598-019-44677-3

 Los linfocitos de sangre periférica (PBL) son linfocitos maduros que circulan en la sangre en lugar de estar localizados en los órganos. Para la investigación básica y los requisitos clínicos, es crucial contar con un método de recolección sin etiqueta confiable que pueda aislar PBL de manera viable y adecuada para establecer sistemas de cultivo in vitro. Sin embargo, el aislamiento de PBL a partir de sangre completa es difícil, por lo que se requiere el desarrollo de un método rápido y seguro para realizar esta tarea. La tecnología de microfluidos ofrece oportunidades que desafían el rendimiento de los métodos a macroescala. En este estudio, propusimos un chip de microfluidos en espiral simple para el aislamiento eficiente y de alto rendimiento de linfocitos de una muestra con glóbulos rojos prelizados. Esta plataforma de microfluidos en espiral no se basa en anticuerpos o marcadores biológicos para marcar las células de interés mientras aísla los linfocitos, sino que enriquece los linfocitos B y T a través de las diferentes propiedades físicas que son intrínsecas a los linfocitos y otras células sanguíneas. El dispositivo se utilizó para lograr una separación de alto rendimiento (~1,3 × 105 células/min) de linfocitos con alta viabilidad (>95 %). En comparación con enfoques anteriores, nuestro dispositivo proporcionó una separación de linfocitos rápida, sin etiquetas, de alto rendimiento y segura.